Diferença entre RT PCR e QPCR

Diferença de chave - RT PCR vs QPCR
 

A reação em cadeia da polimerase é uma técnica usada para amplificar uma região específica do DNA em vitro. Devido à invenção dessa técnica por Kary Mullis em 1983, os cientistas são capazes de fazer de milhares a milhões de cópias de fragmentos de DNA específicos para fins de pesquisa. Atualmente, tornou-se uma técnica comum e realizada rotineiramente em laboratórios clínicos e de pesquisa para uma ampla variedade de aplicações. Existem variações da técnica tradicional de PCR, como RT PCR, PCR aninhado, PCR multiplex, Q PCR, RT - QPCR, etc. RT PCR e Q PCR são duas variações importantes da PCR. A principal diferença entre RT PCR e Q PCR é que O RT PCR é usado para detectar a expressão gênica através da criação deDNA complementar transcritos (cDNA) do RNA enquanto O Q PCR é usado para medir quantitativamente os produtos de PCR em tempo real usando corantes fluorescentes.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é RT PCR
3. O que é QPCR
4. Comparação lado a lado - RT PCR vs QPCR
5. Resumo

O que é RT PCR?

A reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa (RT PCR) é uma variante da PCR que é usada para detectar a expressão do RNA. É um método muito importante para detectar a expressão do mRNA nos tecidos. O RT PCR é empregado quando o material de partida da amostra é RNA. Na RT PCR, o RNAm modelo é primeiro convertido em DNA complementar. Esta etapa é catalisada pela enzima transcriptase reversa e o processo é conhecido como transcrição reversa. Em segundo lugar, a PCR tradicional é empregada para o cDNA recém-sintetizado para a amplificação.

A RT PCR é uma técnica altamente sensível que requer uma quantidade relativamente pequena de amostra de RNA. O RT PCR é comumente usado no diagnóstico e quantificação de espécies de RNA, especialmente vírus de RNA, como vírus da imunodeficiência humana e vírus da hepatite C.

Figura 01: Técnica de RT PCR

O que é QPCR?

A PCR quantitativa (QPCR) é uma variante da PCR que é usada para medir quantitativamente os produtos de PCR. É também chamada de reação em cadeia da polimerase em tempo real, pois mede a amplificação em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real. É um método adequado para determinar a quantidade de uma sequência ou gene alvo presente em uma amostra. A característica interessante do QPCR é que ele combina amplificação e quantificação verdadeira em uma única etapa. Portanto, a necessidade de eletroforese em gel na detecção pode ser eliminada pela técnica QPCR. O QPCR usa corantes fluorescentes para marcar produtos de PCR durante as reações de PCR que eventualmente levam à quantificação direta. Quando os produtos de PCR se acumulam, os sinais fluorescentes também são acumulados e serão medidos pela máquina em tempo real. QPCR pode ser combinado com RT PCR. É conhecido como RT - QPCR ou QRT - PCR e é considerado o método mais poderoso, sensível e quantitativo para a detecção de níveis de RNA nas células ou tecidos..

SYBR Green e Taqman são dois métodos empregados para detectar ou observar o processo de amplificação da PCR em tempo real. O método SYBR Green é realizado usando um corante fluorescente chamado SYBR green e detecta a amplificação ligando o corante para produzir DNA de fita dupla. O Taqman é realizado usando sondas de dupla marcação e detecta a amplificação por degradação da sonda pela polimerase Taq e liberações do fluoróforo, conforme mostrado na figura 02. Ambos os métodos monitoram o progresso do processo de amplificação e relatam a quantidade do produto em tempo real.

A PCR em tempo real tem uma ampla variedade de aplicações, como quantificação de expressão gênica, análise de RNA micro e não codificante, genotipagem SNP, detecção de variantes de número de cópias, detecção de mutações raras, detecção de organismos geneticamente modificados, detecção de agentes infecciosos, etc..

Figura 02: Técnica quantitativa de PCR

Qual é a diferença entre RT PCR e QPCR?

RT PCR vs QPCR
RT PCR é uma técnica usada para detectar a expressão gênica por amplificação.	O QPCR é uma técnica que amplifica o DNA e quantifica os produtos de PCR em tempo real.
Envolvimento da enzima transcriptase reversa
A transcriptase reversa enzimática é usada para RT PCR.	A transcriptase reversa enzimática não é usada para QPCR.
Uso de moléculas marcadas com fluorescência
Corantes ou sondas marcados com fluorescência não são utilizados para RT PCR.	Corantes ou sondas marcados com fluorescência são usados ​​para QPCR.
Quantificação do produto de PCR
A menos que acoplado ao QPCR, o RT PCR não quantifica o produto de PCR.	QPCR mede quantitativamente o produto de PCR.
Material de início
O material de partida é o mRNA.	O material de partida é o DNA.
Síntese de cDNA
DNA complementar é produzido durante a RT PCR.	DNA complementar não é produzido durante o QPCR.

Resumo - RT PCR vs QPCR

RT PCR e QPCR são duas versões do PCR tradicional. A técnica de RT PCR é realizada para amostras de mRNA e é conduzida pela transcrição reversa e produção de cDNA. O QPCR é usado para quantificar produtos de PCR durante os ciclos térmicos de PCR em tempo real usando corantes fluorescentes ou sondas marcadas. No QPCR, a quantidade de produto de PCR é representada pelos sinais fluorescentes emitidos pela amostra. O RT PCR é popularmente usado como um processo de amplificação, enquanto o QPCR é comumente usado como um processo de quantificação. Esta é a diferença entre RT PCR e QPCR.

Referências:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo e GK Agrawal. "PCR em tempo real: revolucionando a detecção e análise de expressão de genes". Genômica atual. Bentham Science Publishers Ltd., junho de 2007. Web. 03 Abr. 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh e Jo Vandesompele. "Análise de expressão gênica baseada em RT-qPCR simples e sensível de amostras de FFPE." Nature News. Nature Publishing Group, 22 de fevereiro de 2016. Web. 03 Abr. 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon e C. Mathieu. "O uso da PCR em tempo real da transcriptase reversa para a quantificação da expressão do gene de citocina". Jornal de Técnicas Biomoleculares: JBT. A Associação de Instalações de Recursos Biomoleculares, março de 2003. Web. 03 Abr. 2017

Cortesia da imagem:
1. "Taqman" Por usuário: Braindamaged - trabalho próprio do carregador original (Domínio Público) via Commons Wikimedia
2. “Reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa” Por Jpark623 - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia