Diferença entre Sanger Sequencing e Pyrosequencing

Diferença de chave - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
 

O seqüenciamento de DNA é muito importante para a análise de DNA, pois o conhecimento do arranjo correto de nucleotídeos em uma região específica do DNA revela muitas informações importantes sobre o mesmo. Existem diferentes métodos de sequenciamento de DNA. Sequenciamento de Sanger e Pirosequenciamento são dois métodos diferentes de sequenciamento de DNA amplamente utilizados em Biologia Molecular. A principal diferença entre o seqüenciamento Sanger e o Poseose é o seguinte: A sequenciação de Sanger usa didesoxinucleotídeos para finalizar a síntese de DNA para ler a sequência de nucleotídeos enquanto a piroseqüenciação detecta a liberação de pirofosfato incorporando os nucleotídeos e sintetizando a sequência complementar para ler a ordem precisa da sequência.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é o sequenciamento Sanger
3. O que é pirosequência
4. Comparação Lado a Lado - Sequência de Sanger vs Pirosequenciamento
5. Resumo

O que é o sequenciamento Sanger?

O sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento de DNA de primeira geração desenvolvido por Frederick Sanger e suas faculdades em 1977. Também é conhecido como Sequenciação de terminação em cadeia ou Sequenciamento de didesoxi uma vez que se baseia na terminação da cadeia por didesoxinucleotídeos (ddNTPs). Esse método foi amplamente utilizado por mais de 30 anos até o desenvolvimento do New Generation Sequencing (NGS). A técnica de sequenciamento de Sanger permitiu a descoberta da ordem correta dos nucleotídeos ou a ligação de um fragmento de DNA específico. Baseia-se na incorporação seletiva de ddNTPs e no término da síntese de DNA durante a em vitro Replicação de DNA. A ausência de grupos 3 'OH para continuar a formação da ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes é uma característica única dos ddNTPs. Portanto, uma vez que o ddNTP é anexado, o alongamento da cadeia cessa e termina a partir desse ponto. Existem quatro ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP - usados ​​no seqüenciamento Sanger. Esses nucleotídeos interrompem o processo de replicação do DNA quando são incorporados à cadeia crescente de DNA e resultam em comprimentos variados de DNA curto. A eletroforese em gel capilar é usada para organizar essas cadeias curtas de DNA por seus tamanhos em um gel, como mostra a Figura 01.

Figura 1: Eletroforese em gel capilar do DNA curto sintetizado

Para em vitro replicação do DNA, poucos requisitos devem ser fornecidos. São enzimas de DNA polimerase, DNA modelo, iniciadores oligonucleotídicos e desoxinucleotídeos (dNTPs). No sequenciamento de Sanger, a replicação do DNA é realizada em quatro tubos de ensaio separados, juntamente com quatro tipos de ddNTPs separadamente. Os desoxinucleotídeos não são totalmente substituídos pelos respectivos ddNTPs. Uma mistura do dNTP específico (por exemplo; dATP + ddATP) é incluída no tubo e replicada. Quatro produtos de tubo separados são aplicados em gel em quatro poços separados. Então, lendo o gel, a sequência pode ser construída como mostra a Figura 02.

Figura 02: Sequenciamento de Sanger

O sequenciamento de Sanger é uma técnica importante que ajuda em muitas áreas da biologia molecular. O projeto do genoma humano foi concluído com sucesso com o auxílio dos métodos baseados em sequenciamento de Sanger. O sequenciamento de Sanger também é útil no sequenciamento de DNA alvo, pesquisa de câncer e doenças genéticas, análise de expressão gênica, identificação humana, detecção de patógenos, sequenciamento microbiano etc..

Existem várias desvantagens do seqüenciamento Sanger:

• O comprimento do DNA que está sendo sequenciado não pode exceder 1000 pares de bases
• Apenas um fio pode ser sequenciado por vez.
• O processo é demorado e caro.

Portanto, novas técnicas avançadas de seqüenciamento foram desenvolvidas com o tempo para superar esses problemas. No entanto, o sequenciamento Sanger ainda está em uso devido aos resultados altamente precisos de até aproximadamente 850 fragmentos de comprimento de par de bases.

O que é pirosequência?

A pirosequenciamento é uma nova técnica de seqüenciamento de DNA baseada no "sequenciamento por síntese". Esta técnica baseia-se na detecção da liberação de pirofosfato após a incorporação de nucleotídeos. O processo é empregado por quatro enzimas diferentes: DNA polimérico, ATP sulfurilase, luciferase e apirase e dois substratos adenosina 5 'fosfossulfato (APS) e luciferina.

O processo começa com a ligação do iniciador ao modelo de DNA de fita simples e a DNA polimerase inicia a incorporação de nucleotídeos complementares a ele. Quando os nucleotídeos se unem (polimerização de ácido nucleico), ele libera grupos de pirofosfato (dois grupos fosfato ligados) e energia. Cada adição de nucleotídeo libera quantidade equimolar de pirofosfato. O pirofosfato se converte em ATP por ATP sulfurilase na presença do substrato APS. O ATP gerado conduz a conversão de luciferina em oxiluciferina mediada por luciferase, produzindo luz visível em quantidades proporcionais à quantidade de ATPs. A luz é detectada por um dispositivo de detecção de fótons ou por um fotomultiplicador e cria um pirograma. A apirase degrada ATP e dNTPs não incorporados na mistura de reação. A adição de dNTP é feita uma vez por vez. Uma vez que a adição de nucleótido é conhecida de acordo com a incorporação e detecção da luz, a sequência do molde pode ser determinada. O pirograma é usado para gerar a sequência nucleotídica do DNA da amostra, como mostrado na Figura 03.

A pirosequenciação é muito importante na análise do polimorfismo de nucleotídeo único e no seqüenciamento de trechos curtos de DNA. A alta precisão, flexibilidade, facilidade de automação e processamento paralelo são as vantagens da pirosequenciação sobre as técnicas de sequenciamento da Sanger.

Figura 03: Pirosequenciação

Qual é a diferença entre Sanger Sequencing e Poseosequencing?

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
O sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento de DNA baseado na incorporação seletiva de ddNTPs pela polimerase de DNA e terminação da cadeia.	A pirosequenciação é um método de sequenciamento de DNA baseado na detecção da liberação de pirofosfato mediante a incorporação de nucleotídeos.
Uso do ddNTP
Os ddNTPs são usados ​​para finalizar a replicação do DNA	ddNTPs não são usados.
Enzimas envolvidas
Polimerase de DNA são usadas.	São utilizadas quatro enzimas: DNA polimerase, ATP sulfurilase, Luciferase e Apyrase.
Substratos usados
APS e Luciferin não são usados.	Utilizam-se fosfossulfato de adenosina 5 '(APS) e luciferina.
Temperatura máxima
Este é um processo lento.	Este é um processo rápido.

Resumo - Sequência de Sanger vs Pirosequencing

Sequenciamento de Sanger e Pirosequenciamento são dois métodos de sequenciamento de DNA usados ​​em biologia molecular. A sequenciação de Sanger constrói a ordem dos nucleotídeos em sequência, terminando o alongamento da cadeia, enquanto a piroseqüenciação constrói a ordem precisa dos nucleotídeos em sequência pela incorporação de nucleotídeos e pela detecção da liberação de pirofosfatos. Portanto, a principal diferença entre o seqüenciamento de Sanger e a piroseqüenciação é que o seqüenciamento de Sanger funciona no seqüenciamento por terminação em cadeia, enquanto a pirosequenciamento funciona no sequenciamento por síntese.

Referência:
1. Fakruddin, Md e Abhijit Chowdhury. "Pirosequencing - uma alternativa ao seqüenciamento tradicional de Sanger". American Journal of Bioquímica e Biotecnologia. Publicações de ciência, 02 de março de 2012. Web. 28 de fevereiro de 2017.
2. "Sequenciamento de Sanger". Sequência de Sanger - Tópicos do ScienceDirect. N.p., n.d. Rede. 28 de fevereiro de 2017

Cortesia da imagem:
1. “Didesoxy-Methode” Por Christoph Goemans (modificado) - Dr. Norman Mauder, sobre Base Data de Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Por Enzo na Wikipédia em polonês Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. “Pirosequencing” por microbiologybytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr