Diferença entre primers de PCR e sequenciadores

Diferença de chave - PCR Primers vs Sequenciamento Primers
 

Com os recentes desenvolvimentos no campo da biologia molecular, foram desenvolvidas diferentes técnicas genéticas que tornaram os processos de investigação de diferentes avenidas do sujeito fáceis e precisos. A PCR e outros procedimentos de sequenciamento são duas técnicas importantes. Eles usam subcomponentes diferentes. Os primers são considerados o principal subcomponente comum às técnicas de PCR e de seqüenciamento. Os iniciadores de PCR são utilizados para amplificação de uma sequência de DNA específica enquanto siniciadores de equação são usados ​​no contexto de sequenciar um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua ordem específica da sequência de nucleotídeos. Isto é o diferença chave entre iniciadores de PCR e iniciadores de sequenciação.

CONTEÚDO

1. Visão geral e principais diferenças
2. O que são os Primers PCR
3. O que são os Primers de Sequenciamento
4. Semelhanças entre os primers de PCR e os sequenciadores
5. Comparação lado a lado - Primers para PCR vs Primers para sequenciação em forma de tabela
6. Resumo

O que são os Primers PCR?

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica genética utilizada no campo da biologia molecular para amplificar uma única ou poucas cópias de um segmento de DNA específico e obter muitos milhões de cópias idênticas. Numa reação de PCR, componentes diferentes são usados, incluindo iniciadores. Os iniciadores são cadeias curtas de DNA com um comprimento de nucleotídeo de 18 a 25, tornando-os compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA a serem amplificados. Os primers podem ser um primer direto e reverso. Esses iniciadores se ligam ao fragmento de DNA nos pontos específicos em que a DNA polimerase se liga ao iniciador específico no local e inicia a síntese da nova fita de DNA..

A seleção de iniciadores é um aspecto importante do processo de PCR. A seleção do comprimento do primer é importante. O comprimento ideal seria 18-25 nucleotídeos. Se o comprimento for muito curto ou muito longo, os iniciadores não se ligam à sequência de DNA para serem amplificados com precisão. Primers de comprimento muito curto levam ao recozimento inespecífico do iniciador em diferentes locais da sequência de DNA.

Figura 01: Primers para PCR

O conteúdo de guanina e citosina (GC) em um bom iniciador deve estar na faixa de 40 a 60. A temperatura de recozimento do primer e a temperatura de fusão são fatores vitais durante a PCR. A temperatura de fusão deve ser calculada com precisão e a temperatura de recozimento do primer deve ser de 5 ^{0 0}C menor que a temperatura de fusão. A temperatura de fusão deve ser de 60 ° C e 75 ° C. Temperaturas muito altas ou muito baixas resultarão em atividade menos ativa da DNA polimerase.

O que são Primers de Sequenciamento?

Os iniciadores de sequenciamento são usados ​​no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Para obter bons resultados de seqüenciamento, primers e modelos de alta qualidade são importantes. Assim, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos para uma região específica em que desejamos sequenciar. Também deve estar com uma orientação correta, onde as seqüências são geralmente geradas das extremidades 3 'a 5' dos primers. A sequência deve estar sem auto-hibridação indesejável, como a formação de presilhas em gancho. Não deve conter formação consecutiva de bases guaninas.

A temperatura de fusão (Tm) do primer deve ser adequada às condições do seqüenciamento. Portanto, deve ficar entre 52^oC e 74^oC. A preparação de oligonucleotídeos a serem utilizados como iniciador deve ser purificada para obter o comprimento total desejado da sequência. Se os oligonucleotídeos contiverem impurezas, a sinalização da sequência do primer será sobreposta a partir de diferentes locais de iniciação e também diminuirá o número de células base.

Figura 02: Sequenciadores de primers

A temperatura de fusão do iniciador (Tm) de um oligonucleotídeo determina o quão forte as cadeias complementares de DNA são hibridadas. Tm pode ser considerado como um cálculo termodinâmico em que depende tanto das seqüências de DNA quanto de várias condições, como a concentração de sal. A Tm é importante durante a PCR, em que uma variante denominada sequenciação de ciclo é usada para produzir um grupo de fragmentos terminados com didesoxinucleotídeo. Aqui, o iniciador que é sequenciado será inicialmente recozido alternativamente, depois estendido e finalmente desnaturado para amplificação. Portanto, o valor Tm deve estar entre 52^oC e 74^o C. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser obtidos nos laboratórios de síntese de DNA / RNA, conforme escolha. A pequena escala de síntese usada para sequenciamento de DNA é geralmente de 50 nmol. Além disso, o mais importante é que os primers utilizados para sequenciamento devem ser purificados para estarem livres de impurezas que impedirão a redução da qualidade.

Quais são as semelhanças entre os primers de PCR e os sequenciadores?

• Ambos os Primers de PCR e Primers de Sequenciação são primers usados ​​no processo de amplificação de uma sequência de DNA direcionada.
• Os Primers de PCR e Primers de Sequenciamento são compostos de nucleotídeos.
• Os Primers de PCR e Primers de Sequenciamento são oligômeros curtos.

Qual é a diferença entre os primers de PCR e os sequenciadores?

Primers PCR vs Primers de Sequenciação
Os iniciadores de PCR são cadeias curtas de DNA com um comprimento de sequência de nucleotídeos de 18 a 25, tornando-os compatíveis com a região inicial e final dos fragmentos de DNA que devem ser amplificados.	Primers de sequenciamento são oligômeros curtos que são usados ​​no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica.
Função
Os iniciadores de PCR são usados ​​para amplificação de uma sequência de DNA específica.	Os iniciadores de sequenciamento são usados ​​no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica.
Número de primers necessários
Dois iniciadores; um iniciador direto e um iniciador reverso são usados ​​como iniciadores de PCR.	Precisa apenas de um primer como iniciador de sequenciamento.

Sumário - PCR Primers vs Sequenciamento Primers

Os iniciadores de sequenciamento são usados ​​no contexto de sequenciamento de um fragmento de DNA com a intenção de revelar sua identidade específica. Um iniciador de seqüenciamento será suficiente para executar o processo. Para obter bons resultados de seqüenciamento, primers e modelos de alta qualidade são importantes. Assim, quando os primers são selecionados, eles devem ser exclusivos para uma região específica em que desejamos sequenciar. Os iniciadores de PCR são cadeias curtas de DNA com um comprimento de nucleotídeo de 18 a 25 que é compatível com a região inicial e final dos fragmentos de DNA que devem ser amplificados. Os iniciadores de PCR podem ser um iniciador direto e iniciador reverso. O conteúdo de guanina e citosina (GC) em um bom iniciador deve estar na faixa de 40 a 60. A temperatura de recozimento do primer e a temperatura de fusão são aspectos vitais durante a PCR. Esta é a diferença entre os iniciadores de PCR e os sequenciadores.

Referência:

1. "Reação em cadeia da polimerase (PCR)." Khan Academy. Disponivel aqui
2. "Primers de sequenciamento e design de primer". Primers de sequenciamento e design de primer | Serviços Universitários de DNA | Universidade de Calgary. Disponivel aqui    

Cortesia da imagem:

1.'Primers RevComp'By Zephyris - Trabalho próprio, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 
2.'DNA Sequencin 3 labeling methods 'Por Abizar (carregador original) na Wikipedia - Transferido por Gustavocarra., (Domínio público) via Commons Wikimedia