Diferença entre PCR e seqüenciamento de DNA

Diferença chave - PCR vs seqüenciamento de DNA
 

PCR e seqüenciamento de DNA são duas técnicas importantes em Biologia Molecular. A reação em cadeia da polimerase (PCR) é o processo que cria um grande número de cópias de um fragmento de DNA. Sequenciamento de DNA é a técnica que resulta na ordem precisa dos nucleotídeos de um dado fragmento de DNA. Esta é a principal diferença entre PCR e seqüenciamento de DNA. A PCR é uma das principais etapas envolvidas no sequenciamento de DNA.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é PCR
3. O que é o seqüenciamento de DNA
4. Comparação lado a lado - PCR vs seqüenciamento de DNA
5. Resumo

O que é PCR?

A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é uma técnica de amplificação de DNA usada em Biologia Molecular. Produz milhares a milhões de cópias de um fragmento de DNA específico. Este método foi desenvolvido por Kary Mullis em 1983. Nesta técnica, o fragmento de DNA a ser amplificado serve como molde e a enzima DNA polimerase adiciona nucleotídeos complementares ao iniciador que está disponível na mistura de PCR. No final da reação de PCR, muitas cópias do DNA da amostra são sintetizadas.

Existem diferentes componentes da mistura de PCR, incluindo DNA, DNA polimerase (Taq polimerase), iniciadores (iniciador direto e reverso), nucleotídeos (blocos de construção do DNA) e um tampão. A PCR ocorre dentro de uma máquina de PCR, e a mistura correta de PCR deve ser carregada na máquina e o programa correto deve ser acionado. Essa técnica permite a produção de milhares a milhões de cópias de uma seção específica de DNA a partir de uma quantidade muito pequena de DNA.

As reações de PCR ocorrem de maneira cíclica para produzir a quantidade visível de produtos de PCR em um gel. Há três etapas principais envolvidas em uma reação de PCR, nomeadamente desnaturação, recozimento do primer e extensão da fita, como mostrado na Figura 01. Essas três etapas estão ocorrendo em três temperaturas diferentes. O DNA existe na forma de fita dupla por ligações de hidrogênio entre as bases complementares. Antes da implicação, o DNA de fita dupla deve ser separado um do outro. Isso é feito com uma temperatura alta. A alta temperatura, o desnaturação do DNA de fita dupla em fitas simples. Em seguida, os primers devem se aproximar das extremidades flanqueantes do fragmento específico ou do gene do DNA. Primer é um pequeno pedaço de DNA de fita simples que é complementar à sequência alvo. Os primers direto e reverso recozem com as bases complementares nas extremidades flanqueantes do DNA da amostra desnaturado à temperatura de recozimento. Os primers devem ser resistentes ao calor. Depois que os iniciadores recozem com o DNA da amostra, a enzima taq polimerase inicia a síntese dos novos filamentos adicionando nucleotídeos que são complementares ao DNA alvo. A polimerase Taq é uma enzima estável ao calor isolada de uma bactéria termofílica chamada Thermus aquaticus. O tampão de PCR mantém as condições ideais para a ação da polimerase taq. Estes três estágios das reações de PCR são repetidos para produzir a quantidade necessária de produto de PCR. Após cada reação de PCR, o número da cópia do DNA é dobrado. Portanto, uma amplificação exponencial pode ser observada na PCR. Os produtos de PCR podem ser observados por eletroforese em gel e podem ser purificados para estudos futuros.

Figura 01: Etapas principais de uma reação de PCR

A PCR é uma ferramenta valiosa na pesquisa médica e biológica. A PCR tem um valor especial na ciência forense, pois pode amplificar o DNA para estudos de pequenas amostras de criminosos e criar perfis de DNA forense. A PCR é amplamente utilizada em muitas áreas da biologia molecular, incluindo genotipagem, clonagem de genes, detecção de mutações, sequenciamento de DNA, microarranjos de DNA e testes de paternidade, etc..

Figura 02: Reação em cadeia da polimerase

O que é o seqüenciamento de DNA?

O sequenciamento de DNA é a determinação de uma ordem precisa dos nucleotídeos - adenina, guanina, citosina e timina em um dado fragmento de DNA. A informação genética é armazenada nas seqüências de DNA usando a ordem correta dos nucleotídeos. Portanto, é muito importante saber a ordem precisa dos nucleotídeos em um fragmento de DNA sobre a estrutura e função dos genes.

O protocolo de seqüenciamento de DNA envolve diferentes processos. O primeiro passo é o isolamento do DNA interessado ou do DNA genômico de um organismo. Usando PCR (como descrito acima), a região desejada do DNA deve ser amplificada. O produto de PCR amplificado deve ser separado por eletroforese em gel e purificado. Fragmentos amplificados são servidos como modelos para sequenciamento. O sequenciamento pode ser feito seguindo o método de sequenciamento Sanger ou sequencial de alto rendimento. O sequenciamento de Sanger requer eletroforese capilar dos fragmentos de DNA resultantes. A determinação da ordem correta dos nucleotídeos pode ser feita através da leitura manual de autoradiografias ou usando seqüenciadores de DNA automatizados.

O seqüenciamento de genes contribuiu para o projeto do genoma humano e facilitou o mapeamento do genoma humano em 2003. Na investigação forense, o sequenciamento de DNA permitiu a identificação de indivíduos que mostram sequências únicas de DNA e identificam os criminosos. Na medicina, o seqüenciamento de DNA pode ser usado para detectar os genes responsáveis ​​por doenças genéticas e outras, encontrar genes defeituosos e substituí-los por genes corretos. Na agricultura, informações de sequenciamento de DNA de alguns microorganismos são usadas para produzir culturas transgênicas com características economicamente desejadas.

Figura 03: Sequenciamento de DNA

Qual é a diferença entre PCR e DNA Sequencing?

PCR vs Sequenciamento de DNA
O processo de PCR cria milhares a milhões de cópias do fragmento de DNA interessado.	Seqüenciamento de DNA é o processo de determinar a ordem precisa dos nucleotídeos em um dado fragmento de DNA.
Resultado
A PCR cria milhares a milhões de cópias de um fragmento de DNA específico	Isso resulta na ordem correta das bases em um fragmento de DNA específico.
Envolvimento de ddNTPs
A PCR não requer ddNTPs. Ele usa dNTPs.	Seqüenciamento de DNA requer ddNTPs para terminar a formação de cadeia.

Resumo - PCR vs Sequenciamento de DNA

PCR e seqüenciamento de DNA são ferramentas muito importantes em muitas áreas da biologia molecular. A amplificação dos fragmentos de DNA é feita pela técnica de PCR, enquanto a ordem correta dos nucleotídeos de um fragmento de DNA é determinada pelo sequenciamento de DNA. Esta é a diferença entre PCR e seqüenciamento de DNA.

Referência:
1. "Reação em cadeia da polimerase (PCR)." Centro Nacional de Informação Biotecnológica. U.S. National Library of Medicine, n.d. Rede. 21 de fevereiro de 2017.
2. Shendure, Jay e Hanlee Ji. "Sequenciamento de DNA de última geração". Nature News. Nature Publishing Group, 09 de outubro de 2008. Web. 21 de fevereiro de 2017

Cortesia da imagem:
1. “PCR Steps” Por Tinojasontran - Trabalho próprio (Domínio Público) via Commons Wikimedia
2. "Reação em cadeia da polimerase" Por Enzoklop - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "DNA sequence" Por Sjef - Trabalho próprio (Domínio Público) via Commons Wikimedia