Diferença entre Northern Southern e Western Blotting

Diferença chave - Northern vs Southern vs Western Blotting

A detecção de sequências específicas de DNA, RNA e proteínas é essencial para vários tipos de estudos em biologia molecular. A eletroforese em gel é uma técnica que separa DNA, RNA e proteínas de acordo com seus tamanhos. A partir dos perfis de gel, uma sequência de DNA específica, uma sequência de RNA ou uma proteína são detectadas pelas técnicas especiais chamadas de transferência e hibridação com sondas marcadas. Existem três tipos diferentes de métodos de mancha: sul, norte e oeste. A principal diferença entre o norte do sul e o oeste da mancha está no tipo de molécula que ele detecta em uma amostra. Southern blotting é um método que detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA. Northern blotting é uma técnica que detecta uma sequência de RNA específica de uma amostra de RNA. Western blotting é um método que detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é Southern Blotting
3. O que é Northern Blotting
4. O que é Western Blotting
5. Comparação lado a lado - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Resumo

O que é Southern Blotting?

A técnica Southern blotting foi desenvolvida por E. M. Southern em 1975 para a identificação de uma sequência específica de DNA a partir de uma amostra de DNA. Esta é a primeira técnica de transferência introduzida na biologia molecular. Permitiu a detecção de genes específicos do DNA, fragmentos específicos do DNA, etc. Existem várias etapas envolvidas na técnica de "Southern Blotting". Eles são os seguintes.

O DNA é isolado da amostra e digerido com endonucleases de restrição.
A amostra digerida é separada por eletroforese em gel de agarose.
Fragmentos de DNA no gel são desnaturados em filamentos únicos pelo uso de uma solução alcalina.
O DNA de fita simples é transferido para uma membrana filtrante de nitrocelulose por transferência capilar.
O DNA transferido é fixado permanentemente na membrana.
DNA fixo na membrana é hibridizado com sondas marcadas.
O DNA não ligado é lavado da membrana por lavagem.
O filme de raios X é exposto à membrana e uma autorradiografia é preparada.

A transferência de Southern é aplicada para diferentes aspectos da biologia molecular. É útil no mapeamento de RFLP, estudos forenses, metilação de DNA na expressão de genes, detecção de genes mutados em desordens genéticas, impressão digital de DNA, etc..

Figura 01: Técnica Southern Blotting

O que é Northern Blotting?

Northern blotting é um método desenvolvido para detectar uma sequência específica de RNA ou mRNA de uma amostra para estudar a expressão gênica. Essa técnica foi desenvolvida por Alwine, Kemp e Stark em 1979. Difere das técnicas de transferência de manchas na região oeste e oeste devido a várias etapas. No entanto, essa técnica também é realizada por eletroforese em gel, transferência e hibridação com sondas e detecção marcadas específicas. A técnica de Northern blotting é realizada da seguinte maneira.

O RNA é extraído da amostra e separado por eletroforese em gel.
O RNA é transferido do gel para uma membrana manchada e fixado.
A membrana é tratada com uma sonda marcada, preparada a partir de cDNA ou RNA (a sonda é complementar a uma sequência específica da amostra).
A sonda é incubada com a membrana para se ligar a uma sequência específica.
As sondas não ligadas são lavadas.
Fragmentos hibridados são detectados por uma auto-radiografia.

Northern blotting é uma ferramenta importante na detecção e quantificação de mRNA hibridado, estudando a degradação do RNA, avaliação da meia-vida do RNA, detecção de splicing de RNA, estudo da expressão gênica, etc..

Figura 02: Northern Blotting

O que é Western Blotting?

O Western blotting é um método de detecção de uma proteína específica de uma mistura de proteínas pelo uso de anticorpo marcado. Portanto, western blot também é conhecido como immunoblot. Esta técnica foi introduzida por Towbin et al em 1979 e agora é realizado rotineiramente nos laboratórios para análise de proteínas. Os passos são os seguintes.

As proteínas são extraídas da amostra
As proteínas são separadas por seus tamanhos usando eletroforese em gel de poliacrilamida
Moléculas separadas são transferidas para uma membrana de PVDF ou membrana de nitrocelulose por eletroporação
A membrana é bloqueada para ligação inespecífica com os anticorpos
As proteínas transferidas são ligadas ao anticorpo primário (anticorpos marcados com enzima).
A membrana é lavada para remover anticorpos primários não específicos
Os anticorpos ligados são detectados adicionando um substrato e detectando o precipitado colorido formado

O Western blotting é útil na detecção de anticorpos anti-HIV em uma amostra de soro humano. Western blot também pode ser usado como teste confirmatório da infecção pela hepatite B e teste definitivo para a doença da vaca louca.

Figura 03: Western Blotting

Qual é a diferença entre Northern Southern e Western Blotting?

Northern vs Southern vs Western Blotting
Tipo de molécula detectada
Northern Blotting	Northern blotting detecta uma sequência de RNA específica de uma amostra de RNA.
Southern Blotting	Southern blotting detecta uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA.
Western Blotting	Western blotting detecta uma proteína específica de uma amostra de proteína.
Tipo de Gel
Northern Blotting	Utiliza gel de agarose / formaldeído.
Southern Blotting	Isso usa um gel de agarose.
Western Blotting	Utiliza gel de poliacrilamida.
Método de mancha
Northern Blotting	Esta é uma transferência capilar.
Southern Blotting	Esta é uma transferência capilar.
Western Blotting	Esta é uma transferência elétrica.
Sondas usadas
Northern Blotting	sondas de cDNA ou RNA marcadas radioativa ou não radioativamente.
Southern Blotting	As sondas de DNA são marcadas radioativamente ou não radioativamente.
Western Blotting	Os anticorpos primários são usados como sondas.
Sistema de Detecção
Northern Blotting	Isso é feito usando uma autoradiografia ou detecção de mudança de luz ou cor.
Southern Blotting	Isso é feito usando uma autoradiografia, detecção de mudança de luz ou cor.
Western Blotting	Isso é feito usando a detecção de mudança de luz ou cor.

Resumo - Northern vs Southern vs Western Blotting

A mancha é uma técnica especial desenvolvida para a identificação de DNA, RNA ou proteína específicos das amostras. Existem três procedimentos de transferência separados, a norte, sul e oeste, para detectar um tipo específico de molécula. A técnica Northern blotting é projetada para detectar uma sequência específica de RNA a partir de uma mistura de RNA. A técnica Southern blotting permite a detecção de uma sequência de DNA específica de uma amostra de DNA e a técnica Western blotting é desenvolvida para identificar uma proteína específica de uma mistura de proteínas.

Referências
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Visão Geral da Transferência de Proteínas." Revista Norte-Americana de Ciências Médicas. Publicações Medknow & Media Pvt Ltd, março de 2014. Web. 27 de março de 2017
2. Brown, T. "Southern blotting". Protocolos atuais em imunologia. Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, maio de 2001. Web. 27 de março de 2017
3. Ele, Shan L. "Northern blot". Métodos em enzimologia. Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, 2013. Web. 27 de março de 2017

Cortesia da imagem:
1. “Northern Blot Scheme” Por RNA405 - Trabalho próprio (Domínio Público) via Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" Por Amanthabagdon - Obra própria (Domínio Público) via Commons Wikimedia

Ciência e Natureza