Diferença entre NGS e Sanger Sequencing

Diferença de chave - NGS vs Sanger Sequencing
 

O Sequenciamento de Nova Geração (NGS) e o Sequenciamento de Sanger são dois tipos de técnicas de sequenciamento de nucleotídeos desenvolvidas ao longo do tempo. O método de sequenciamento de Sanger foi amplamente utilizado por muitos anos e o NGS o substituiu recentemente devido às suas vantagens. A principal diferença entre NGS e Sanger Sequencing é que O NGS trabalha com o princípio de sequenciar milhões de sequências simultaneamente de forma rápida através de um sistema de sequenciamento, enquanto o Sanger Sequencing trabalha com o princípio de terminação da cadeia devido à incorporação seletiva de didesoxinucleotídeos pela enzima DNA polimerase durante a replicação do DNA e a separação de fragmentos resultante pelo capilar. eletroforese.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é o seqüenciamento de nucleotídeos
3. O que é NGS
4. O que é o sequenciamento Sanger
5. Comparação Lado a Lado - Sequência NGS vs Sanger
6. Resumo

O que é o seqüenciamento de nucleotídeos?

A informação genética é armazenada nas sequências nucleotídicas do DNA ou RNA de um organismo. O processo de determinação da ordem correta dos nucleotídeos (usando quatro bases) em um dado fragmento (em um gene, agrupamento de genes, cromossomo e genoma completo) é conhecido como sequenciamento de nucleotídeos. É muito importante em estudos genômicos, forenses, virologia, sistemático biológico, diagnóstico médico, biotecnologia e em muitos outros campos analisar a estrutura e a função dos genes. Existem diferentes tipos de métodos de seqüenciamento desenvolvidos por cientistas. Entre eles, Sequenciação Sanger desenvolvido por Frederick Sanger em 1977 foi amplamente utilizado e popularizado por um longo período de tempo até Sequenciamento de próxima geração substituiu.

O que é NGS?

O Next Generation Sequencing (NGS) é um termo usado para se referir aos modernos processos de sequenciamento de alto rendimento. Ele descreve várias tecnologias modernas de seqüenciamento diferentes que revolucionaram os estudos genômicos e a biologia molecular. Essas técnicas são o sequenciamento Illumina, o sequenciamento Roche 454, o sequenciamento de íons prótons e o sequenciamento SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection). Os sistemas NGS são mais rápidos e baratos. Quatro métodos principais de seqüenciamento de DNA são usados ​​nos sistemas NGS, a saber; pirosequenciamento, sequenciamento por síntese, sequenciamento por ligação e sequenciamento de semicondutores de íons. Um grande número de filamentos de DNA ou RNA (milhões de) pode ser sequenciado paralelamente. Permite o seqüenciamento de todo o genoma de organismos dentro de um curto período de tempo, ao contrário do sequenciamento de Sanger, que leva mais tempo.

O NGS tem muitas vantagens sobre o método Sanger de sequenciamento convencional. É um processo de alta velocidade, mais preciso e econômico, que pode ser realizado com um pequeno tamanho de amostra. O NGS pode ser usado em estudos metagenômicos, na detecção de variações dentro de um genoma individual devido a inserções e deleções, etc., e na análise de expressões gênicas.

Figura_1: Desenvolvimentos no sequenciamento NGS

O que é o sequenciamento Sanger?

O sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento desenvolvido por Frederick Sanger e seus colegas em 1977 para determinar a ordem exata dos nucleotídeos de um dado fragmento de DNA. Também é conhecido como sequência de terminação em cadeia ou Sequenciamento de didesoxi. O princípio de funcionamento deste método é a terminação da síntese de cadeia por incorporação seletiva de um didesoxinucleotídeo de terminação de cadeia (ddNTPs), como ddGTP, ddCTP, ddATP e ddTTP pela DNA polimerase durante a replicação do DNA. Os nucleotídeos normais têm grupos 3 'OH para a formação de uma ligação fosfodiéster entre nucleotídeos adjacentes para continuar a formação da fita. No entanto, os ddNTPs não possuem esse grupo 3 'OH e são incapazes de formar ligações fosfodiéster entre nucleotídeos. Portanto, o alongamento da cadeia é interrompido.

Nesse método, o DNA de fita simples a ser sequenciado serve como fita padrão para em vitro Síntese de DNA. Outros requisitos são o oligonucleotídeo iniciador, precursores desoxinucleotídicos e a enzima DNA polimerase. Quando as extremidades flanqueadoras do fragmento alvo são conhecidas, os iniciadores podem ser facilmente projetados para replicação do DNA. Quatro reações de síntese de DNA separadas são realizadas em quatro tubos separados. Cada tubo possui ddNTPs separados, juntamente com outros requisitos. A partir do nucleotídeo específico, uma mistura de dNTPs e ddNTPs é adicionada. Da mesma forma, quatro reações separadas são realizadas em quatro tubos com quatro misturas. Após as reações, a detecção de fragmentos de DNA e a conversão do padrão de fragmento em informações de sequência são realizadas. Os fragmentos de DNA resultantes são desnaturados por calor e separados por eletroforese em gel. Se forem utilizados nucleotídeos radioativos, o padrão de bandas no gel de poliacrilamida pode ser visualizado por autorradiografia. Quando este método utiliza os didesoxinucleotídeos marcados com fluorescência, ele pode ser mitigado na leitura do gel e passado através de um feixe de laser a ser detectado pelo detector fluorescente. Para evitar erros que possam surgir quando uma sequência é lida pelo olho e é inserida manualmente em um computador, esse método foi desenvolvido para o uso do seqüenciador automático associado ao computador.

Este é o método usado para sequenciar o DNA do projeto Genoma Humano. Esse método ainda está em uso com modificações avançadas, pois fornece informações precisas sobre a sequência, apesar de ser um processo caro e lento.

Figure_2: Sequência de Sanger

Qual é a diferença entre NGS e Sanger Sequencing?

NGS vs Sanger Sequencing
O Next Generation Sequencing (NGS) refere-se aos modernos processos de sequenciamento de alto rendimento. Descreve várias tecnologias modernas de seqüenciamento diferentes	Sanger Sequencing é um método de seqüenciamento desenvolvido por Frederick Sanger para determinar a ordem exata dos nucleotídeos de um dado fragmento de DNA.
Relação custo-benefício
NGS é um processo mais barato, pois reduz o tempo, mão de obra e produtos químicos.	Este é um processo caro, pois leva tempo, mão de obra e mais produtos químicos.
Rapidez
Isso é mais rápido, pois a detecção química e a detecção de sinais de muitos fios estão ocorrendo paralelamente.	Isso consome tempo, uma vez que a detecção química e a detecção de sinal acontecem como dois processos separados e somente no fio pode ler de cada vez.
Confiabilidade
NGS é confiável.	O sequenciamento Sanger é menos confiável
Tamanho da amostra
NGS requer menos quantidade de DNA.	Esse método precisa de uma grande quantidade de DNA modelo.
Bases de DNA por fragmento sequenciado
O número de bases de DNA por fragmento sequenciado é menor que o método de Sanger	As sequências geradoras são mais longas que as sequências NGS.

Resumo - NGS vs Sanger Sequencing

NGS e Sanger Sequencing são técnicas de sequenciamento de nucleotídeos amplamente utilizadas em Biologia Molecular. O sequenciamento de Sanger é um método de sequenciamento precoce que foi substituído pelo NGS. A principal diferença entre o NGS e o sequenciamento Sanger é que o NGS é um processo de alta velocidade, mais preciso e econômico do que o sequenciamento Sanger. Ambas as técnicas criaram grandes surtos em genética e biotecnologia.

Referência:
1. Nowrousian, Minou. “Técnicas de sequenciamento de última geração para microorganismos eucarióticos: soluções baseadas em sequenciamento para problemas biológicos.” Célula eucariótica. Sociedade Americana de Microbiologia, setembro de 2010. Web. 18 de fevereiro de 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen e A. R. Coulson. "Sequenciamento de DNA com inibidores de terminação de cadeia". Anais da Academia Nacional de Ciências 74.12 (1977): 5463-467. Rede.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu e Maggie Law. "Comparação de sistemas de sequenciamento de próxima geração". Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Rede.

Cortesia da imagem:
“Sanger-sequencing” Por Estevezj - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 
“Desenvolvimentos no sequenciamento de próxima geração” Por Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia