Diferença entre clonagem de genes e PCR

Diferença chave - Clonagem de genes vs PCR
 

A síntese de muitas cópias de DNA de um fragmento de DNA específico é denominada amplificação de DNA. Existem dois processos principais de amplificação de DNA, a clonagem de genes e a PCR. A principal diferença entre clonagem de genes e PCR é, a clonagem de genes produz várias cópias de um gene específico na Vivo construindo um DNA recombinante e crescendo dentro de uma bactéria hospedeira enquanto a PCR produz milhões de cópias de um fragmento de DNA específico em vitro passando por ciclos repetidos de desnaturação e síntese.

CONTEÚDO
1. Visão geral e principais diferenças
2. O que é a clonagem de genes
3. O que é PCR
4. Comparação lado a lado - clonagem de genes vs PCR
5. Resumo

O que é a clonagem de genes?

A clonagem de genes é uma técnica empregada para localizar e multiplicar um gene específico do DNA genômico extraído de um organismo através da construção de DNA recombinante. O DNA genômico contém milhares de genes diferentes codificados para proteínas. Quando o DNA é extraído, inclui todos os genes possíveis que pode suportar. A técnica de clonagem de genes permitiu a detecção de um gene específico a partir do DNA total. Portanto, a clonagem de genes serve como uma ferramenta importante em biologia molecular.

A criação de uma biblioteca genômica de um organismo é essencial na clonagem de genes se não houver nenhuma pista sobre a localização do gene relevante no DNA. Uma biblioteca genômica é feita usando as seguintes etapas.

Passo 1: Extração do DNA total de um organismo que contém o gene desejado.

Passo 2: Digestão por restrição do DNA extraído para produzir pequenos fragmentos gerenciáveis. Esta etapa é facilitada pelas endonucleases de restrição.

Etapa 3: Seleção de um vetor adequado e abertura do DNA do vetor usando as mesmas endonucleases de restrição. Plasmídeos bacterianos são comumente usados ​​como vetores para transportar DNA estranho. Plasmídeos são pequenos círculos de DNA localizados dentro de bactérias.

Passo 4: Combinação do DNA do vetor e do DNA fragmentado para produzir a molécula de DNA recombinante. Esta etapa é governada pela DNA ligase.

Etapa 5: Transferência de moléculas de DNA recombinante para bactérias hospedeiras. Esta etapa é conhecida como transformação e é realizada usando um choque térmico..

Etapa 5: Rastreio de células bacterianas transformadas num meio de cultura. Uma população mista de células hospedeiras transformadas e não transformadas é obtida no final do processo de transformação. Como gene de interesse, inclui apenas células hospedeiras transformadas. Portanto, é necessário selecionar células transformadas. A seleção é feita usando meio seletivo que contém antibióticos. Somente as células transformadas crescem neste meio de triagem, permitindo a seleção.

Etapa 6: Crescimento de bactérias para produzir uma biblioteca de genes. Nesta etapa, as células hospedeiras transformadas são introduzidas em meios de cultura frescos, o que fornece requisitos ótimos de crescimento. O total de colônias nas placas de cultura representa a biblioteca genômica desse organismo.

Etapa 7: A molécula de DNA recombinante contendo o gene de interesse deve ser rastreada a partir de milhares de fragmentos clonados de DNA recombinante. Isso pode ser realizado com o uso de sondas que marcam o gene específico ou a proteína específica resultante desse gene.

Depois que o gene interessado que contém a colônia bacteriana é identificado a partir do total de colônias, é possível fazer milhões de cópias do plasmídeo recombinante que contém o gene.

A clonagem de genes é usada no estabelecimento de bibliotecas de genes, produzindo genomas especiais de proteínas, vitaminas, antibióticos, hormônios, seqüenciamento e mapeamento de organismos, fazendo várias cópias do DNA de indivíduos em forense etc..

Figura_1: Clonagem de genes

O que é PCR?

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica que gera um grande número de cópias de um fragmento de DNA específico. A amplificação exponencial de uma sequência de DNA específica é obtida por PCR sob em vitro condições. Essa técnica é uma ferramenta muito poderosa em Biologia Molecular, pois pode multiplicar uma pequena amostra de DNA em uma quantidade utilizável. A PCR foi introduzida por Kary Mullis em 1983 e esta invenção premiada criou um enorme avanço na Biologia Molecular.

A técnica de PCR segue reações repetidas de PCR, como mostrado na Figura 02. Uma reação de PCR consiste em três etapas principais que ocorrem em três temperaturas diferentes; desnaturação de fita dupla no DNA em 94 ^{0 0}C, recozimento de primers a 68 ^{0 0}Alongamento de C e fio em 72 ^{0 0}C. Portanto, quando a PCR é realizada, a flutuação da temperatura deve ser altamente mantida para uma replicação adequada. A PCR é realizada em uma máquina de PCR dentro de tubos de PCR. Os tubos de PCR são carregados com misturas de PCR corretas contendo DNA modelo, polimerase Taq, iniciadores, dNTPs e tampão. A desnaturação do DNA da amostra de fita dupla em DNA de fita simples é feita quebrando as ligações de hidrogênio entre bases complementares de 94 a 98 ^{0 0}C. Em seguida, cadeias simples de DNA modelo são expostas para os primers. Um par de primers (frente e verso) deve ser fornecido e deve ser termoestável para tolerar altas temperaturas. Os iniciadores são sequências curtas de DNA de cadeia simples, complementares às extremidades do fragmento de DNA alvo. Primers sintéticos são usados ​​em PCR. Os primers se ligam às bases complementares do DNA da amostra e iniciam a síntese de uma nova fita. Este passo é catalisado por uma enzima chamada Taq polimerase; uma enzima polimerase de DNA termoestável isolada de Thermus auqaticus. Quando estão disponíveis iniciadores e nucleotídeos (blocos de construção), a polimerase Taq constrói a nova cadeia de DNA complementar ao DNA modelo. No final do programa de PCR, o fragmento de DNA amplificado é observado usando eletroforese em gel. Se for necessária uma análise mais aprofundada, o produto de PCR é purificado do gel.

A PCR é muito útil no diagnóstico e monitoramento de doenças genéticas e adquiridas, identificação de criminosos (no campo forense), estudo da estrutura e função de um segmento-alvo de DNA, sequenciamento e mapeamento de genomas de organismos, etc. A PCR tornou-se uma técnica laboratorial de rotina em laboratórios de pesquisa em biologia médica e molecular entre cientistas, uma vez que possui uma ampla variedade de aplicações.

Figura_2: Reação em Cadeia da Polimerase

Qual é a diferença entre a clonagem de genes e a PCR?

Clonagem de genes vs PCR
A clonagem de genes é o processo de fazer várias cópias de um gene específico na Vivo através do DNA recombinante e transformando-se em uma bactéria hospedeira.	A técnica de PCR produz várias cópias de uma sequência de DNA específica em vitro através de ciclos repetidos de reações de PCR.
Exigência de construir DNA recombinante
O DNA recombinante é produzido para localizar o gene.	DNA recombinante não é produzido.
Necessidade de trabalho
Esse processo é trabalhoso.	Trabalho intensivo não é necessário.
Processo in vivo ou in vitro
A construção do DNA recombinante é em vitro e a amplificação do DNA é na Vivo.	A amplificação do DNA acontece completamente em vitro.

Resumo - Clonagem de Gene vs PCR

A clonagem de genes e a PCR são dois métodos utilizados para a amplificação do DNA. PCR é um em vitro processo que faz várias cópias de DNA de um fragmento de DNA específico sem usar DNA recombinante e um organismo hospedeiro. A clonagem de genes é principalmente uma na Vivo processo que resulta em várias cópias de um gene interessado dentro do organismo hospedeiro através da construção de DNA recombinante. Esta é a diferença entre a clonagem de genes e a PCR.

Referência:
1. Griffiths, Anthony JF. "Clonando um gene específico". Análise genética moderna. Biblioteca Nacional de Medicina dos EUA, 01 de janeiro de 1999. Web. 22 de fevereiro de 2017
2. "Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)." Centro Nacional de Informação Biotecnológica. U.S. National Library of Medicine, n.d. Rede. 22 de fevereiro de 2017

Cortesia da imagem:
1. "Figura 17 01 06" Por CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2. “PCR” Por Madprime - Trabalho próprio (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia